Ecco come il coronavirus infetta le cellule e perché Delta è così pericolosa

Dall'inizio della pandemia di COVID-19, gli scienziati hanno sviluppato un'analisi dettagliata di come SARS-CoV-2 infetta le cellule. Separando il processo di infezione, sperano di trovare modi migliori per interromperlo attraverso trattamenti e vaccini migliorati e scoprire perché gli ultimi ceppi, come la variante Delta, sono più trasmissibili

Ciò che è emerso da 19 mesi di lavoro, sostenuto da decenni di ricerca sul coronavirus, è un resoconto di come SARS-CoV-2 invade le cellule umane. Gli scienziati hanno scoperto adattamenti chiave che aiutano il virus ad aggrapparsi alle cellule umane con una forza sorprendente e poi a nascondersi una volta dentro.

 Successivamente, mentre lascia le cellule, SARS-CoV-2 esegue una fase di elaborazione cruciale per preparare le sue particelle a infettare ancora più cellule umane. Questi sono alcuni degli strumenti che hanno permesso al virus di diffondersi così rapidamente e mietere milioni di vite. "Ecco perché è così difficile da controllare", afferma Wendy Barclay, virologa presso l'Imperial College di Londra.

Ogni SARS-CoV-2 (particella virale) ha una superficie esterna costellata di 24-40 proteine ​​spike disposte a casaccio che sono la chiave per fondersi con le cellule umane2 . Per altri tipi di virus, come l'influenza, le proteine ​​di fusione esterne sono relativamente rigide. I picchi di SARS-CoV-2, tuttavia, sono estremamente flessibili e ruotano in tre punti, secondo il lavoro pubblicato nell'agosto 2020 dal biochimico Martin Beck presso l'Istituto di biofisica Max Planck di Francoforte, in Germania, e dai suoi colleghi.

Ciò consente alle punte di fluttuare, oscillare e ruotare, il che potrebbe rendere più facile la scansione della superficie cellulare e il legame di più punte a una cellula umana. Non ci sono dati sperimentali simili per altri coronavirus, ma poiché le sequenze di proteine ​​spike sono altamente conservate dal punto di vista evolutivo, è giusto presumere che il tratto sia condiviso, afferma Beck.

All'inizio della pandemia, i ricercatori hanno confermato che gli RBD delle proteine ​​spike di SARS-CoV-2 si attaccano a una proteina familiare chiamata recettore ACE2, che adorna l'esterno della maggior parte delle cellule umane della gola e dei polmoni. Questo recettore è anche il punto di attracco per SARS-CoV, il virus che causa la sindrome respiratoria acuta grave (SARS). Ma rispetto a SARS-CoV, SARS-CoV-2 si lega ad ACE2 con una forza 2-4 volte maggiore  perché diversi cambiamenti nel RBD stabilizzano i suoi hotspot di legame con il virus.

Le varianti preoccupanti di SARS-CoV-2 tendono ad avere mutazioni nella subunità S1 della proteina spike, che ospita gli RBD ed è responsabile del legame al recettore ACE2. (Una seconda subunità spike, S2, provoca la fusione virale con la membrana della cellula ospite.)

La variante Alpha, ad esempio, include dieci cambiamenti nella sequenza della proteina spike, che si traduce in una maggiore probabilità che gli RBD rimangano nella posizione "su". "Sta aiutando il virus rendendo più facile l'ingresso nelle cellule", afferma Priyamvada Acharya, biologa strutturale presso il Duke Human Vaccine Institute di Durham, nella Carolina del Nord, che sta studiando le mutazioni degli spike. La variante Delta, che si sta diffondendo in tutto il mondo, ospita molteplici mutazioni nella subunità S1, di cui tre nell'RBD che sembrano migliorare la capacità dell'RBD di legarsi all'ACE2 ed eludere il sistema immunitario.

Ingresso limitato

Una volta che i picchi virali si legano all'ACE2, altre proteine ​​sulla superficie della cellula ospite avviano un processo che porta alla fusione delle membrane virali e cellulari.   Il virus che causa la SARS, SARS-CoV, utilizza uno dei due enzimi proteasi dell'ospite per entrare: TMPRSS2 (pronunciato "tempress due") o catepsina L. TMPRSS2 è la via più veloce, ma SARS-CoV spesso entra invece attraverso un endosoma - una bolla circondata da lipidi - che si basa sulla catepsina L. Quando i virioni entrano nelle cellule per questa via, tuttavia, le proteine ​​antivirali possono intrappolarli.

SARS-CoV-2 differisce da SARS-CoV perché utilizza in modo efficiente TMPRSS2, un enzima presente in quantità elevate all'esterno delle cellule respiratorie. Innanzitutto, TMPRSS2 taglia un sito sulla subunità S2 dello spike. Quel taglio espone una serie di amminoacidi idrofobici che si seppelliscono rapidamente nella membrana più vicina, quella della cellula ospite. Successivamente, la punta estesa si ripiega su se stessa, come una cerniera, costringendo le membrane virali e cellulari a fondersi.

Il virus quindi espelle il suo genoma direttamente nella cellula. Invadendo in questo modo a molla, SARS-CoV-2 infetta più velocemente di SARS-CoV ed evita di essere intrappolato negli endosomi, secondo un lavoro pubblicato ad aprile da Barclay e dai suoi colleghi dell'Imperial College di Londra.

La rapida entrata del virus tramite TMPRSS2 spiega perché il farmaco contro la malaria clorochina non ha funzionato negli studi clinici come trattamento per COVID-19, nonostante i primi studi promettenti in laboratorio. Si è scoperto che utilizzavano cellule che si affidano esclusivamente a catepsine per l'ingresso endosomiale. "Quando il virus si trasmette e si replica nelle vie aeree umane, non utilizza endosomi, quindi la clorochina, che è un farmaco che interferisce con gli endosomi, non è efficace nella vita reale", afferma Barclay.

La scoperta indica anche gli inibitori della proteasi come un'opzione terapeutica promettente per impedire a un virus di utilizzare TMPRSS2, catepsina L o altre proteasi per entrare nelle cellule ospiti. Un inibitore del TMPRSS2, il mesilato camostat, approvato in Giappone per il trattamento della pancreatite, ha bloccato l'ingresso del virus nelle cellule polmonari, ma il farmaco non ha migliorato gli esiti dei pazienti in uno studio clinico iniziale.

"Dal mio punto di vista, dovremmo avere a disposizione inibitori della proteasi come ampi antivirali per combattere nuovi focolai di malattie e prevenire future pandemie fin dall'inizio", afferma Stefan Pöhlmann, direttore dell'Unità di biologia delle infezioni presso il Centro tedesco per i primati di Göttingen, che ha ha condotto la ricerca sul legame di ACE2 e sulla via TMPRSS2.

Concorrenza mortale

I prossimi passi dell'infezione sono più oscuri. "Ci sono molte più scatole nere una volta che sei all'interno della cellula", afferma il chimico Janet Iwasa dell'Università dello Utah a Salt Lake City, che sta sviluppando un'animazione annotata del ciclo di vita virale. "C'è più incertezza e ipotesi in competizione". Dopo che il virus ha sparato il suo genoma di RNA nella cellula, i ribosomi nel citoplasma traducono due sezioni di RNA virale in lunghe stringhe di amminoacidi, che vengono poi tagliate in 16 proteine, incluse molte coinvolte nella sintesi dell'RNA. Successivamente, vengono generati più RNA che codificano per un totale di 26 proteine ​​virali note, comprese quelle strutturali utilizzate per creare nuove particelle virali, come lo spike e altre proteine ​​accessorie. In questo modo, il virus inizia a sfornare copie del proprio RNA messaggero. Ma ha bisogno del macchinario della cellula per tradurre quegli mRNA in proteine.

I coronavirus prendono il controllo di quel macchinario in molti modi. La virologa Noam Stern-Ginossar e il suo team presso il Weizmann Institute of Science di Rehovot, in Israele, hanno ingrandito tre meccanismi con cui SARS-CoV-2 sopprime la traduzione dell'mRNA dell'ospite a favore del proprio. Nessuno è esclusivo di questo virus, ma la combinazione, la velocità e l'entità degli effetti sembrano uniche, afferma Stern-Ginossar.

Innanzitutto, il virus elimina la concorrenza: la proteina virale Nsp1, una delle prime proteine ​​tradotte quando arriva il virus, recluta le proteine ​​dell'ospite per tagliare sistematicamente tutti gli mRNA cellulari che non hanno un tag virale. Quando il team di Stern-Ginossar ha messo lo stesso tag all'estremità di un mRNA dell'ospite, l'mRNA non è stato tagliato.

In secondo luogo, l'infezione riduce del 70% la traduzione complessiva delle proteine ​​nella cellula. Nsp1 è di nuovo il principale colpevole, questa volta bloccando fisicamente il canale di ingresso dei ribosomi in modo che l'mRNA non possa entrare, secondo il lavoro di due gruppi di ricerca. La poca capacità di traduzione che rimane è dedicata agli RNA virali, afferma Stern-Ginossar.

Infine, il virus spegne il sistema di allarme della cellula. Ciò accade in molti modi, ma il team di Stern-Ginossar ha identificato un chiaro meccanismo per SARS-CoV-2: il virus impedisce all'mRNA cellulare di uscire dal nucleo, comprese le istruzioni per le proteine ​​destinate ad allertare il sistema immunitario in caso di infezione. Un secondo team ha confermato questa scoperta e ha nuovamente indicato Nsp1: la proteina sembra intasare i canali di uscita nel nucleo in modo che nulla possa sfuggire.

Poiché le trascrizioni geniche non possono uscire dal nucleo, le cellule infette non rilasciano molti interferoni: si tratta di proteine ​​di segnalazione che avvertono il sistema immunitario della presenza di un virus. SARS-Cov-2 è particolarmente efficiente nello spegnere questo sistema di allarme: rispetto ad altri virus respiratori, inclusi SARS-CoV e virus respiratorio sinciziale, l'infezione da SARS-CoV-2 induce livelli significativamente più bassi di interferoni. E questo giugno, i ricercatori hanno riportato mutazioni nella variante Alpha che sembrano consentirle di sottomettere la produzione di interferone in modo ancora più efficiente.

"È chiaro che SARS-CoV-2 è un virus molto veloce che ha una capacità unica di impedire al nostro sistema immunitario di riconoscere e combattere l'infezione nelle prime fasi", afferma Stern-Ginossar. Quando il sistema immunitario si rende conto che c'è un virus, ce n'è così tanto che le proteine ​​della risposta immunitaria a volte inondano il flusso sanguigno a una velocità maggiore del normale, il che può causare danni. I medici hanno visto all'inizio della pandemia che alcune persone con COVID-19 che si ammalano gravemente sono danneggiate da una risposta immunitaria iperattiva alla SARS-CoV-2, nonché dal virus stesso. Alcuni trattamenti provati agiscono attenuando questa risposta immunitaria.

Stazione di ristrutturazione

Una volta che il virus ha preso il controllo della traduzione dell'ospite, inizia un rifacimento della casa, rimodellando ampiamente l'interno e l'esterno della cellula secondo le sue esigenze. In primo luogo, alcune delle proteine ​​virali appena create viaggiano sulla superficie della cellula e fuoriescono dalla membrana della cellula ospite. Lì, attivano un canale di ioni calcio ospite, che espelle un rivestimento grasso all'esterno della cellula, lo stesso rivestimento che si trova sulle cellule che si fondono naturalmente insieme, come le cellule muscolari. A questo punto, la cellula infetta si fonde con le cellule vicine che esprimono ACE2, sviluppandosi in massicce cellule respiratorie individuali riempite con un massimo di 20 nuclei.

Queste strutture fuse, chiamate sincizi, sono indotte da infezioni virali come l'HIV e il virus dell'herpes simplex, ma non dal virus della SARS, afferma il biologo molecolare Mauro Giacca del King's College di Londra, che ha guidato il team che ha pubblicato la scoperta il 18 aprile . Egli ipotizza che la formazione di sincizi permetta alle cellule infette di prosperare per lunghi periodi di tempo, sfornando sempre più virioni. "Questo non è un virus mordi e fuggi", dice. "Persiste". Un secondo team, guidato dal ricercatore Qiang Sun dell'Accademia cinese delle scienze mediche di Pechino, ha scoperto che alcune cellule infette da COVID-19 formano persino sincizi con i linfociti, una delle cellule immunitarie del corpo. Questo è un noto meccanismo di evasione immunitaria da parte delle cellule tumorali, ma non da parte dei virus. Suggerisce che le cellule infette evitino il rilevamento immunitario semplicemente afferrando e fondendosi con gli esploratori immunitari vicini.

All'interno della cellula, si stanno verificando ancora più cambiamenti. Come altri coronavirus, SARS-CoV-2 trasforma il lungo e sottile reticolo endoplasmatico (ER), una rete di membrane piatte coinvolte nella sintesi e nel trasporto delle proteine, in sfere a doppia membrana, come se l'ER stesse soffiando delle bolle. Queste vescicole a doppia membrana (DMV) potrebbero fornire un luogo sicuro per replicare e tradurre l'RNA virale, proteggendolo dai sensori immunitari innati nella cellula, ma tale ipotesi è ancora oggetto di studio.

Le proteine ​​coinvolte nella produzione di DMV potrebbero essere buoni bersagli farmacologici, perché sembrano essere necessarie per la replicazione virale. Ad esempio, è necessaria una proteina ospite, TMEM41B, per mobilitare il colesterolo e altri lipidi per espandere le membrane ER in modo che tutte le parti del virus si adattino all'interno. "Quando si elimina TMEM41B, si ha un forte impatto sull'infezione", afferma Vineet Menachery, ricercatore sul coronavirus presso l'Università del Texas Medical Branch di Galveston, coinvolto nella ricerca. Anche la proteina transmembrana del coronavirus Nsp3 potrebbe essere un bersaglio: crea un poro a forma di corona nelle pareti dei DMV per trasportare l'RNA virale appena prodotto.

La maggior parte dei virus che hanno un involucro esterno, noto come un involucro, formano questa caratteristica assemblandosi direttamente sul bordo della cellula, cooptando parte della membrana plasmatica della cellula durante la loro uscita. Ma le nuove proteine ​​del coronavirus prendono una strada diversa.

Per anni, le prove hanno suggerito che i coronavirus vengono trasportati fuori dalla cellula attraverso il complesso del Golgi, un organello che funziona come un ufficio postale, confezionando molecole in membrane e inviandole ad altre parti della cellula. Lì, il virus forma un involucro lipidico dalla membrana del complesso di Golgi; i virioni appena formati vengono quindi trasportati all'interno delle vescicole di Golgi sulla superficie cellulare, dove vengono sputati fuori dalla cellula, afferma la virologa e biologa cellulare Carolyn Machamer della Johns Hopkins University di Baltimora, nel Maryland, che ha studiato i coronavirus per 30 anni.

Ma a dicembre, la biologa cellulare Nihal Altan-Bonnet del National Heart, Lung e Blood Institute degli Stati Uniti a Bethesda, nel Maryland, e i suoi colleghi hanno riferito di aver rilevato coronavirus che lasciano la cellula attraverso i lisosomi, bidoni della spazzatura cellulari pieni di enzimi che si decompongono. parti cellulari. Il blocco del percorso secretorio basato sul Golgi non sembra influenzare la quantità di virus infettivo rilasciato, afferma Altan-Bonnet. Le prove del suo team  suggeriscono che le proteine ​​virali formano un involucro gemmando nel pronto soccorso, quindi assumono i lisosomi per uscire dalla cellula. I ricercatori stanno attualmente testando inibitori che bloccano il processo di uscita dei lisosomi come potenziali candidati antivirali.

Lasciare una cellula attraverso il Golgi o i lisosomi è lento e inefficiente rispetto al germogliamento da una membrana plasmatica, quindi gli scienziati non sanno perché SARS-CoV-2 lo fa. Machamer sospetta che la composizione lipidica di un involucro derivato dal Golgi o dal lisosoma sia in qualche modo più vantaggiosa per il virus rispetto a quella della membrana plasmatica. "Se comprendessimo un po' meglio questa parte, ci sarebbero grandi opportunità per nuove terapie antivirali", afferma.

Ultima fetta

All'uscita dalla cellula, un altro evento trasforma questo virus in un colosso infettivo: un rapido taglio in un sito di cinque amminoacidi prepara il virus a colpire il suo prossimo obiettivo. Laddove altri coronavirus hanno un singolo amminoacido arginina alla giunzione delle subunità S1 e S2 del picco, SARS-CoV-2 ha una linea di cinque amminoacidi: prolina, arginina, arginina, alanina e arginina. "Poiché il sito era insolito, ci siamo concentrati su di esso e si è scoperto che, sì, il sito è essenziale per l'invasione delle cellule polmonari", afferma Pöhlmann. Nel maggio 2020, lui e i suoi colleghi hanno riferito che una proteina della cellula ospite chiamata furina riconosce e taglia quella stringa di amminoacidi e il taglio è "essenziale" affinché il virus entri in modo efficiente nelle cellule polmonari umane.

Non è la prima volta che i ricercatori hanno identificato un sito di scissione della furina su un virus; ce l'hanno anche i virus dell'influenza aviaria altamente patogeni, afferma Barclay. Quando un collega ha inviato a Barclay un ceppo di SARS-CoV-2 in coltura che aveva perso spontaneamente il sito di scissione della furina, il suo team ha scoperto che i furetti infettati da questo ceppo rilasciano particelle virali in quantità inferiori rispetto a quelli infettati dal ceppo pandemico, e lo hanno fatto. non trasmettere l'infezione agli animali vicini. Nello stesso momento in cui il team di Barclay ha riportato i suoi risultati in una prestampa del settembre 2020, uno studio nei Paesi Bassi ha anche scoperto che il coronavirus con un sito di scissione della furina intatto entra nelle cellule delle vie aeree umane più velocemente di quelle senza di essa.

Si sospetta che il furin tagli il sito ad un certo punto durante l'assemblaggio del virione, o appena prima del rilascio. Il tempismo potrebbe spiegare perché il virus esce attraverso il Golgi o i lisosomi, afferma Tom Gallagher, virologo della Loyola University di Chicago in Illinois. "Il virus, una volta assemblato, si sposta in un organello dove può essere immerso in presenza della proteasi furinosa".

Tagliando il legame tra le subunità S1 e S2, il taglio della furina scioglie le proteine ​​del picco virione in modo che durante l'ingresso nella cellula rispondano a un secondo taglio da TMPRSS2, che espone l'area idrofoba che si seppellisce rapidamente in una membrana della cellula ospite, dice Gallagher. Se i picchi non sono pre-tagliati dalla furina - e non lo sono sempre - bypassano TMPRSS2 ed entrano attraverso la via endosomiale più lenta, se non del tutto.

Due varianti del coronavirus, Alpha e Delta, hanno alterato i siti di scissione della furina. Nella variante Alpha, l'aminoacido prolina iniziale viene modificato in un'istidina (P681H); nella variante Delta, viene modificato in un'arginina (P681R). Entrambi i cambiamenti rendono la sequenza meno acida e più basica è la serie di amminoacidi, più efficacemente la furina la riconosce e la taglia, afferma Barclay. "Potremmo ipotizzare che questo sia il virus che migliora ulteriormente nella trasmissione".

Più tagli di furin significano più proteine ​​spike innescate per entrare nelle cellule umane. Nella SARS-CoV, viene innescato meno del 10% delle proteine ​​spike, afferma Menachery, il cui gruppo di laboratorio ha quantificato le proteine ​​spike innescate, ma deve ancora pubblicare questo lavoro. In SARS-CoV-2, tale percentuale sale al 50%. Nella variante Alpha, è più del 50%. Nella variante Delta altamente trasmissibile, il gruppo ha scoperto, più del 75% dei picchi è innescato per infettare una cellula umana.

Incognite conosciute

La comunità scientifica sta ancora grattando la superficie della sua comprensione di SARS-CoV-2. Le incognite chiave includono il numero di recettori ACE2 necessari per legarsi a ciascuna proteina spike; quando esattamente il sito S2 viene tagliato da TMPRSS2; e il numero di picchi necessari per la fusione della membrana virus-cellula, afferma McLellan, e questo è solo per l'ingresso. Nell'aprile 2020, un team dell'Università della California, a San Francisco, ha identificato almeno 332 interazioni tra SARS-CoV-2 e proteine umane.Non è facile stare al passo con il virus in rapida mutazione. La maggior parte delle mutazioni finora sono associate all'efficacia con cui il virus si diffonde, non a quanto il virus danneggia l'ospite, concordano gli esperti. Questo mese, uno studio ha riportato che la variante Delta è cresciuta più rapidamente e a livelli più elevati all'interno dei polmoni e della gola delle persone rispetto alle versioni precedenti del virus. Ma non è ancora certo come le mutazioni di Delta abbiano potenziato la variante in questo modo, afferma Stern-Ginossar. "Questo è qualcosa che molti laboratori stanno cercando di capire."

fonte: Nature