Diagnosi prenatale per le anomalie cromosomiche con NIPT

Specificità e sensibilita sono significativamente superiori rispetto allo screening non invasivo combinato o Bi Test (TN+PAPP-A/βHCG) i cui falsi positivi si attestano intorno al 5% circa. Proprio per questo, i NIPT riducono drasticamente il ricorso alle indagini diagnostiche invasive, riducendo di fatto il numero degli aborti collegati a queste tecniche e le possibili, se pur rare, complicanze per le gestanti. Se il NIPT è positivo và eseguita l’amniocentesi  meglio se con cariotipo molecolare con tecnica Array-CGH. Il DNA anomalo rilevato potrebbe derivare dalla placenta e non dal feto (discrepanza feto-placentare).

Il vero limite dei NIPT è il costo anche se sempre più coppie decidono di effettuarlo.

In maggio 2015, il Ministero Italiano della Salute ha pubblicato le linee guida per il corretto utilizzo dei NIPT basati sullo studio del cell-free DNA (cfDNA) fetale[1]. Tra gli aspetti esaminati: metodiche, impatto sociale ed economico, sensibilità e specificità, viene posta  particolare attenzione alla Frazione Fetale (FF) ovvero la quantità di cfDNA fetale rilevata nel campione di sangue analizzato rispetto al cfDNA materno totale. Secondo la letteratura scientifica e le linee guida nazionali e internazionali [2-4] per essere affidabile il risultato deve essere ottenuto a partire da una percentuale di DNA fetale libero non inferiore al 4% del totale del DNA libero presente nel sangue materno.

Ad oggi non si conosce ancora il reale “limit of detection” (LOD) di FF al quale una specifica metodologia possa identificare una aneuploidia fetale. La presenza di una bassa FF oltre che richiedere la ripetizione del test, è associata ad un aumentato rischio di aneuploidie fetali ed è negativamente correlata con il peso materno. Infatti, l’aumentata quantità del cfDNA materno in donne obese può mascherare la FF rendendo difficoltoso lo screening delle aneuploidie [5-6]. Come gestire questi casi?

Nel 2015 uno studio italiano condotto da Fiorentino, ha determinato il LOD dell’analisi NIPT per valutarne specificità e sensibilità in pazienti con una FF<4% basandosi sulla tecnologia MPS [7].  In questo studio la validazione e l’applicazione clinica del protocollo NIPT con un valore limite della FF del 2%, ha permesso di identificare 25 (23.8%) aneuploidie con FF compresa tra 2 e 4%. In queste pazienti le aneuploidie riscontrate non sarebbero state identificate utilizzando NIPT con limite del FF>4%. Dall’applicazione clinica del test non è stato ottenuto nessun falso negativo e i valori di sensibilità e specificità non sono stati influenzati dalla presenza di campioni con bassi livelli di FF.  L’analisi statistica dei dati ha dimostrato che esiste un incremento di circa 6-volte (p>0.001) dell’incidenza di aneuploidie nei campioni con con FF 2-4% versus quelli con una FF>4% [8].

 L’applicazione di un protocollo NIPT con un valore limite della FF del 2% capace di analizzare con accuratezza anche campioni con bassi livelli di FF offre quindi diversi vantaggi. In primis riduce il numero delle cancellazioni del test e delle ripetizioni del prelievo di sangue materno, che in caso di secondo insuccesso invierebbero la gestante ad un test diagnostico invasivo. Nelle donne in forte sovrappeso potrebbe ridurre le possibilità di un fallimento del test e rappresentare una più che valida opzione per altre metodologie di NIPT con limite di FF maggiore del 4%.

I NIPT vengono eseguiti dai laboratori di genetica accreditati. Inizialmente le company erano localizzate in USA, Inghilterra e Cina, ma già da alcuni anni le tecniche di sequenziamento NGS (Next Generation Sequencing) volte all’esecuzione dei NIPTS sono state importate anche da alcuni laboratori italiani, così garantendo maggior tutela per la tracciabilità e stabilità dei campioni di sangue che non viaggiano per il mondo rischiando di deteriorarsi a per eventuali ritardi di consegna, vengono refertati in italiano e inviati direttamente al ginecologo.

Tra i NIPT eseguiti in Italia, allo stato attuale, il Test Karyo è il gold standard. Questo NIPT utilizza tecniche di sequenziamento di seconda generazione “Next-Generation Sequencing, NGS”, che prevedono il sequenziamento dell’intero genoma attraverso il “Massive Parallel Sequencing, MPS8-10”, o di specifiche regioni o polimorfismi di singoli nucleotidi (SNP) [9-10]. Nel complesso, consente di rilevare il 95.5% delle anomalie cromosomiche evidenziabili in gravidanza e il 99.1% di quelle riscontrate alla nascita, arrivando ad un livello di “detection rate” molto simile a quello del cariotipo fetale tradizionale (96.9%) ottenuto con  tecniche di diagnosi prenatale invasiva. Pur rimanendo un test di screening che non sostituisce la diagnosi prenatale invasiva si è dimostrato altamente sensibile e specifico (>99.9%) tanto che può essere utilizzato come esame di approfondimento in caso di esito positivo agli screening del primo trimestre.

Karyo è in grado di verificare i falsi positivi per trisomia 21 prodotti da Bi Test e altri NIPT  che indagano solo le 3 principali trisomie, in quanto permette di evidenziare le  CNV materne Benigne sul cromosoma 21, alterazioni riconosciute in letteratura tra le possibili cause di falsi positivi [11].

Si può eseguire anche in gravidanze gemellari o gravidanze insorte dopo fecondazione assistita. Come gli altri NIPT, non può però essere considerato appieno un test diagnostico, in quanto il DNA estratto dal sangue materno è di derivazione placentare e pertanto la positività del test potrebbe dipendere da una discrepanza feto-placentare). Nei casi positivi và sempre eseguita l’amniocentesi, meglio se con Cariotipo Molecolare con tecnica Array-CGH.

Da circa un anno, è stata messa a punto una versione più avanzata. KaryoPlus, è in grado di individuare anche 9 tra le principali sindromi da microdelezione e, a tutt’oggi, rappresenta il NIPT con il massimo livello di approfondimento d’indagine. Si esegue sia in gravidanze spontanee che in gravidanze insorte da fecondazione assistita autologa o eterologa ma non si esegue, invece, in gravidanze gemellari.

Con Karyo e KaryoPlus si può determinare il fattore Rh fetale in casi di madre Rh negativa e padre Rh positivo per decidere se effettuare o meno la profilassi con immunoglobuline anti-RhD a 28 settimane [12].

Gli aspetti tecnici innovativi del test KaryoPlus sono rappresentati da una maggiore risoluzione (60 Milioni di reads vs 30 Milioni) e una maggiore capacità di evidenziare le alterazioni cromosomiche strutturali submicroscopiche (>7 Mb vs >10 Mb) come le microdelezioni.

Tali sindromi (Tab.N.1) presentano un’importanza clinica variabile a seconda dei geni mancanti del cromosoma coinvolto, della regione cromosomica interessata e delle relative dimensioni. Sono sindromi rare, il rischio non dipende dall’età materna e in assenza di storia familiare è lo stesso per tutte le coppie. La mancanza di segni ecografici prima delle 26 settimane porta ad una diagnosi prenatale tardiva o post nascita. La ragione per cui il test indaga in maniera specifica queste 9 patologie si basa sui seguenti criteri:

• frequenza relativamente alta nei nati vivi (1:4000→1:200.000) rispetto ad altre sindromi rare;
• assenza di segni ecografici prima delle 26 settimane che possano indirizzare la diagnosi in modo specifico su sospetto clinico in assenza di storia familiare;
• elevata mortalità e morbidità alla nascita;
• quadro clinico e storia naturale post-natale noti, anche se in alcuni casi la penetranza è variabile e non sempre tutti i segni e sintomi descritti sono presenti.

Tab.N.1: Sindromi da microdelezione diagnosticabili con Test Karyo Plus

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Bibliografia

1. Ministero della Salute. Linee-Guida Screening prenatale non invasivo basato sul DNA (Non Invasive Prenatal Testing – NIPT). Maggio 2015
2. Benn P et al. Position statement from the Chromosome Abnormality Screening Committee on behalf of the Board of the International Society for Prenatal Diagnosis. Prenat Diagn 2015; 35:725-34
3. Dondorp W et al. Non-invasive prenatal testing for aneuploidy and beyond: challenges of responsible innovation in prenatal screening. Summary and recommendations. Eur J Hum Genet 2015 Apr 1. doi: 10.1038/ejhg.2015.56
4. Gregg AR et al. ACMG statement on noninvasive prenatal screening for fetal aneuploidy. Genet Med 2013;15:395-8
5. 15. Wang E., Batey A., Struble C., et al. Gestational age and maternal weight effects on fetal cell-free DNA in maternal plasma. Prenat. Diagn. 2013;33:662–666
6. 26. Ashoor G, Syngelaki A, Poon LC, et al. Fetal fraction in maternal plasma cell-free DNA at 11-13 weeks’ gestation: relation to maternal and fetal characteristics. Ultrasound Obstet Gynecol 2013;41:26–32.
7. Bono S et al. Massively Parallel Sequencing (MPS) reliably identifies trisomy 21, 18, and 13 in maternal plasma with low-level fetal cell-free DNA fractions. Poster presentation from the European Society of Human Genetics (ESHG) meeting Glasgow 2015.
8. Fiorentino F et al. Feasibility of noninvasive prenatal testing for common fetal aneuploidies in maternal serum with low levels circulating fetal cell-free DNA fraction. Prenat Diagn 2015; 35 Suppl. 1: pag 1
9. 10. Sehnert AJ, Rhees B, Comstock D, et al. Optimal detection of fetal chromosomal abnormalities by massively parallel DNA sequencing of cell-free fetal DNA from maternal blood. Clin Chem 2011;57:1042-9.
10. 11. Zimmermann B, Hill M, Gemelos G, et al. Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y, using targeted sequencing of polymorphic loci. Prenat Diagn 2012;32:1233-1241.
11. Snyder M.W. et al. Copy-Number Variation and False Positive Prenatal Aneuploidy Screening Results  N Engl J Med 2015
12. Finning K, et al. Effect of high throughput RHD typing of fetal DNA in maternal plasma on use of anti-RhD immunoglobulin in RhD negative pregnant women: prospective feasibility study. BMJ. 2008;336: 816-818.