Il calcolo della Frazione Fetale per un corretto utilizzo dei NIPT

La sensibilità per la trisomia 21 è superiore al 99% e i falsi positivi sono molto rari. Oltre le tre principali trisomie, indaga anche le patologie dei cromosomi sessuali, dei cromosomi 9 e 16 e sei delle principali microdelezioni.

Determina il sesso, notizia gradita ai genitori ed anche utile nei casi di malattie genetiche legate al sesso come la Sindrome dell’X Fragile, e il gruppo sanguigno del feto se la mamma è Rh negativa per decidere se effettuare o meno la profilassi anti-D a 28 settimane.

Il test se negativo và considerato rassicurante. Se positivo và eseguita l’amniocentesi poiché il DNA anomalo potrebbe derivare dalla placenta e non dal feto. Dovrebbe essere sempre preceduto da un'ecografia per la ricerca di markers di aneuploidie  che se presenti indirizzano direttamente agli esami invasivi. Il vero limite è il costo anche se sempre più coppie decidono di effettuarlo.

La scoperta che il DNA fetale può essere estratto dal sangue materno oltre che utile è anche intensamente emozionante in quanto riafferma il legame profondo della maternità e della procreazione stessa.

Il Ministero Italiano della Salute, in maggio 2015, ha pubblicato le proprie linee guida per il corretto utilizzo dei NIPT basati sullo studio del cell-free DNA (cfDNA) fetale (1). Tra i vari aspetti esaminati: metodiche, impatto sociale ed economico, sensibilità, specificità e affidabilità, viene posta una particolare attenzione al tema della Frazione Fetale (FF) ovvero la quantità di cfDNA fetale rilevata nel campione di plasma analizzato rispetto al cfDNA totale affinchè l’esame sia attendibile.

Molte delle metodologie NIPT richiedono che la FF sia superiore al 4% (2-4). Questo limite si basa sull’assunto che a basse percentuali di FF le aneuploidie cromosomiche potrebbero non essere identificate. Il documento riporta testualmente in più passaggi infatti che «una soglia ≥4% sia critica per evitare di avere risultati falsi negativi (FNR)» e che «per essere affidabile il risultato debba essere ottenuto a partire da una percentuale di DNA fetale libero non inferiore al 4% del totale del DNA libero presente nel plasma materno».

Anche la letteratura scientifica e le linee guida internazionali (5-9) concordano nel sottolineare l’importanza della FF per una corretta applicazione delle metodologie NIPT, anche se non menzionano il limite assoluto del 4%.

La Society for Maternal-Fetal Medicine (SMFM) afferma che la FF è un importante paramento di riferimento per valutare la qualità dei dati derivanti dall’analisi del DNA fetale estratto da sangue materno, ma allo stesso tempo sottolinea che questa esigenza è legata anche alle differenze tra le diverse  metodiche e alle differenze di sensibilità e risoluzione che ne derivano.

 Il Committee Opinion della SMFM pubblicato su American Journal of Obstetrics & Gynecology nel Giugno 2015 (6)  afferma che alcune tecnologie hanno l’esigenza di limitare le analisi ai campioni che presentano frazione fetale ≥ 4% per esigenze di laboratorio, di conseguenza per altre non è ritenuto un requisito fondamentale.

Anche il recente Position Statement dell’International Society of Prenatal Diagnosis (ISPD), pubblicato su Prenatal Diagnosis in agosto 2015, non menziona il limite di cut-off del 4% ma, riconoscendo le limitazioni derivanti da una bassa FF nel campione, commenta che alcuni laboratori hanno adottato come strategia per la corretta interpretazione dei dati quella di stabilire un limite, ad ora non ancora non specificato, sotto il quale non si effettua l’analisi.

Il valore del 4% deriva da modelli statistici teorici non basati su studi di validazione diretta delle specifiche metodiche NIPT. Il limite del 4% di FF citato delle Linee Guida Italiane, sotto il quale i risultati non sono da considerarsi attendibili, non è quindi un dato sperimentale.

A tutt’oggi non sono ancora stati effettuati studi per verificare il Limit of Detection (LOD), ovvero quale può essere il reale valore più basso di FF al quale una specifica metodologia possa rilevare la presenza di un’aneuploidia. E comunque, sia le Linee Guida Italiane che Internazionali, concordano nell’identificare come campioni a maggiore rischio di aneuploidie cromosomiche (da 4 a 10 volte maggiore), proprio i campioni a bassa FF.

Tutti questi dati sono stati presentati ad importanti congressi internazionali come lo European Human Genetics Conference (EHGC) di Glasgow nel 2015 e l’International Conference On Prenatal Diagnosis (ISPD) di Washington sempre nel 2015 e al momento sono in attesa di pubblicazione su riviste scientifiche del settore.

Bibliografia

1 - Ministero della Salute. Linee-Guida Screening prenatale non invasivo basato sul DNA (Non Invasive Prenatal Testing – NIPT). Maggio 2015

2. Norton ME, Brar H, Weiss J, et al. Non-Invasive Chromosomal Evaluation (NICE) Study: results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol 2012; 207:137

3 - Ashoor G, Poon L, Syngelaki A, et al. Fetal fraction in maternal plasma cell-free DNA at 11-13 weeks' gestation: effect of maternal and fetal factors. Fetal Diagn Ther 2012; 31:237-43

4 - Palomaki GE, Deciu C, Kloza EM, et al. DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study. Genet Med 2012;14:296–305

5 - Committee Opinion No. 640: Cell-free DNA Screening for Fetal Aneuploidy. Obstet Gynecol 2015; 126:e31-7. 6. Society for Maternal-Fetal Medicine (SMFM) Publications Committee #36: Prenatal aneuploidy screening using cell-free DNA. Am J Obstet Gynecol 2015;212:711-6

7 - Benn P, Borrell A, Chiu RW, et al. Position statement from the Chromosome Abnormality Screening Committee on behalf of the Board of the International Society for Prenatal Diagnosis. Prenat Diagn 2015; 35:725-34

8 - Dondorp W, de Wert G, Bombard Y, et al. Non-invasive prenatal testing for aneuploidy and beyond: challenges of responsible innovation in prenatal screening. Summary and recommendations. Eur J Hum Genet 2015 Apr 1. doi: 10.1038/ejhg.2015.56

9 - Gregg AR, Gross SJ, Best RG, et al. ACMG statement on noninvasive prenatal screening for fetal aneuploidy. Genet Med 2013;15:395-8

10 - Canick JA, Palomaki GE, Kloza EM, et al. The impact of maternal plasma DNA fetal fraction on next generation sequencing tests for common fetal aneuploidies. Prenat Diagn 2013;33:667-74

11 - Benn P, Cuckle H. Theoretical performance of non-invasive prenatal testing for chromosome imbalances using counting of cell-free DNA fragments in maternal plasma. Prenat Diagn. 2014; 34:778-83

12 - Fan HC, Quake SR. Sensitivity of noninvasive prenatal detection of fetal aneuploidy from maternal plasma using shotgun sequencing is limited only by counting statistics. PLoS One 2010;5: e10439

13 - Fiorentino F, Spinella F, Bono S, Pizzuti F, Mariano M, Polverari A, Duca S, Cottone G, Nuccitelli A, Sessa M, Baldi M. Feasibility of noninvasive prenatal testing for common fetal aneuploidies in maternal serum with low levels circulating fetal cell-free DNA fraction. Prenat Diagn 2015; 35 Suppl. 1: pag 1

14 - Bono S, Pizzuti F, Mariano M, Polverari A, Duca S, Cottone G, Nuccitelli A, Sessa M, Spinella F, Baldi M, Fiorentino F. Massively Parallel Sequencing (MPS) reliably identifies trisomy 21, 18, and 13 in maternal plasma with low-level fetal cell-free DNA fractions. Poster presentation from the European Society of Human Genetics (ESHG) meeting Glasgow 2015.